Kandungan
Apabila bekerja dengan kromatografi cecair prestasi tinggi (HPLC), penentukuran yang baik adalah sangat penting untuk memastikan hasil yang boleh dipercayai dan berkualiti. Penentukuran yang tepat bagi instrumen HPLC bermula dengan membuat piawai penentukuran yang sesuai. Dalam kebanyakan kes, penentukuran sebenarnya memerlukan satu siri standard penumpuan yang meningkat untuk menghasilkan apa yang dikenali sebagai kurva penentukuran. Ini adalah garis diplot dan persamaan yang berkaitan yang menggambarkan hubungan antara kepekatan bahan kimia yang diuji dan tindak balas pengesan HPLC.
Tentukan kimia yang ingin anda uji untuk menggunakan HPLC ("analyte"). Sebagai contoh, anda mungkin ingin menguji beberapa minuman ringan untuk kandungan fruktosa, di mana fruktosa akan menjadi analit.
Dapatkan kuantiti kimia penganalisis untuk kesucian yang sesuai. Kemurnian biasanya harus melebihi 99% dan analit harus dibeli dari syarikat pembekalan kimia yang bereputasi. Dalam kes fruktosa, sebagai contoh, anda akan membeli fruktosa tulen daripada vendor kimia dan bukan dari kedai runcit.
Tentukan kepekatan analyzer maksimum dan minimum yang dijangkakan dalam sampel yang anda ingin uji pada HPLC. Dalam kes minuman ringan, anda akan memeriksa label minuman dan menentukan kandungan fruktosa terendah dan tertinggi di kalangan minuman yang akan anda uji. Perlu diingat bahawa sampel awal (minuman ringan) boleh dicairkan atau dimanipulasi semasa persediaan untuk analisis (bergantung kepada kaedah HPLC yang digunakan) dan oleh itu kepekatan analyte dalam sampel yang sebenarnya disuntik ke HPLC boleh diubah suai. Ia adalah kepekatan analyte dalam sampel seperti yang dijalankan pada HPLC yang mesti dipertimbangkan.
Tentukan pelarut di mana anda akan membubarkan analit anda untuk membuat piawaian penentukuran. Pelarut ini mesti dapat membubarkan analit dengan betul ke atas kepekatan yang agak luas (sekurang-kurangnya setinggi sampel yang anda hendak uji). Juga, pelarut ini sepatutnya hampir sama dengan "fasa bergerak:" pelarut yang digunakan untuk membawa sampel melalui instrumen HPLC.
Kirakan jumlah analit yang diperlukan untuk membuat larutan "standard saham" analit. Ini didapati dengan mendarabkan kepekatan standard yang diperlukan oleh jumlah yang dikehendaki. Kepekatan analit dalam larutan ini sepatutnya sekurang-kurangnya 10% lebih tinggi daripada kepekatan sampel yang dijangkakan. Jika kepekatan fruktosa yang dijangkakan dalam sampel minuman ringan adalah 8 gram / 100 mililiter, maka standard stok boleh dibuat kepada kepekatan 10 gram fruktosa / 100 mililiter. Satu isipadu yang munasabah ialah 500 mililiter, jadi 8/100 mL x 500 mL = 40 gram fruktosa diperlukan.
Timbang jumlah analit yang diperlukan untuk ketepatan yang sesuai. Selalunya nilai berat dalam gram tepat untuk satu atau dua tempat perpuluhan adalah sesuai, tetapi lebih ketepatan mungkin diperlukan untuk beberapa kaedah.
Pindahkan analyte yang ditimbang ke dalam sebatian volumetrik pada jumlah yang diperlukan dan tambah pelarut yang diingini pada tanda pengisi pada kelalang. Penggunaan kelalang volumetrik (bukannya bikar tamat pengajian, contohnya) meningkatkan ketepatan nilai kepekatan standard stok. Pastikan semua penganalisis dipindahkan ke kelalang; gunakan beberapa pelarut untuk mencuci, jika perlu.
Sekatkan kelalang isipadu dan perlahan-lahan goncang atau terbalikkan sehingga penganalisisnya dibubarkan sepenuhnya.
Buat satu siri pelarasan standard stok yang berbeza-beza dengan memindahkan jumlah standard yang diketahui dalam stok volumetrik, menggunakan pipet untuk pemindahan tepat, kemudian tambah pelarut. Kepekatan standard terendah harus di bawah sampel yang dijangkakan yang paling rendah untuk dianalisis. Dalam contoh minuman ringan, jika kepekatan fruktosa yang diharapkan dalam sampel adalah 2 gram / 100 ml, maka 1 gram / 100 mL standard boleh dibuat. Ini akan dibuat oleh pencairan sepuluh kali ganda daripada standard stok. Siri standard harus mengandungi sejumlah 5 atau 6 konsentrasi, jadi pengenceran tambahan untuk menghasilkan standard mungkin 3, 5 dan 8 gram fruktosa / mL diperlukan. Anda kini mempunyai satu siri penyelesaian standard untuk menentukur HPLC.