Kandungan
Bir genetik sel dikodkan dalam bahan genetiknya, atau DNA. Oleh kerana DNA tidak pernah meninggalkan nukleus sel, agar maklumat ini masuk ke dalam sitoplasma di mana komponen-komponen protein dan komponen biokimia lain berada, perlu terlebih dahulu menyalin DNA ke RNA utusan (mRNA atau poli (A) RNA). MRNA ini kemudian diterjemahkan ke dalam protein yang menjalankan banyak fungsi sel. Untuk mengesan atau mengira mRNA yang sangat jarang berlaku, membuat probe untuk microarrays atau membina perpustakaan molekul DNA pelengkap, mRNA mesti terpencil. Walau bagaimanapun, pengekstrakan RNA (iaitu semua RNA dalam sel) dan pengasingan mRNA seterusnya tidak merupakan proses eksklusif; bekas harus dilakukan agar mRNA dapat diekstrak.
Pengasingan mRNA Daripada Jumlah RNA
Homogenisasi TRIzol: Jumlah RNA termasuk semua mRNA, pemindahan RNA, RNA ribosom, dan RNA bukan kod lain. Untuk memisahkannya dari komponen sel lain, sel pertama kali pecah terbuka untuk melepaskan kandungannya. Ini dilakukan oleh sel-sel resuspending yang dipancarkan oleh sentrifuging (berputar pada kelajuan tinggi) dalam TRIzol Reagent (Life Technologies). Versi TRIzol lain (seperti TRI Reagent Ambion) juga berfungsi.
Jumlah Pengasingan RNA: Serangkaian sentrifugasi digunakan untuk memisahkan komponen yang berlainan (protein, DNA, RNA) sel ke dalam lapisan, atau fasa, dalam penggantungan. Bahagian atas, kuning berwarna fasa terdiri daripada lemak dan boleh dibuang. Fasa yang dikehendaki berwarna merah, mengandungi jumlah RNA dan disimpan. Selepas melakukan pengekstrakan fenol-kloroform dan satu siri pembersihan alkohol menggunakan isopropanol dan etanol, RNA boleh dipecahkan untuk pengasingan mRNA. Tambah perencat RNase untuk mencegah enzim ini merosakkan jumlah RNA.
Pengekstrakan mRNA: Adalah biasa untuk menggunakan kit untuk mengasingkan mRNA, kerana protokol makmal buatan sendiri tidak menghasilkan banyak mRNA yang sangat murni. Kit komersil termasuk FastTrack Invitrogen 2.0 atau Kit Pengasingan mRNA Tulen Poli (A). Langkah-langkah asas ini adalah biasa dengan kit-kit tersebut:
a) Campurkan buffer lysis yang disekat RNase yang disediakan dalam kit dengan sehingga 300 mikrolit RNA total.
b) Panaskan selama 5 minit pada suhu 65 darjah Celsius dan kemudian segerakan sampel pada ais selama satu minit.
c) Campurkan ini dengan 0.5M Natrium Klorida dan kemudian sepenuhnya larutkan Oligo dT (asid oligodoksoksanatidat) dalam sampel ini.
d) Senyapkan sampel ini dan dapatkan supernatan, yang dibasuh beberapa kali dalam satu siri pengawal garam yang mengikat dan rendah yang disediakan dalam kit.
e) MRNA Elute beberapa kali sehingga jumlah kitaran tertentu (contohnya 500 microliters) diperolehi.
f) Nyahceputukan dengan natrium asetat dan preskripsi etanol. Susun semula sehingga 20 microliters diethylpyrocarbonate (DEPC) -membuat air.
g) Simpan di -80 darjah Celcius dan semak kualiti dan kuantiti dengan spektrofotometri.